微生物材料開発室 (JCM) では、以下に示す検査を微生物株受入時並びに保存標品作製時に共通して実施しています。また、必要に応じて既保存株の品質検査も実施しています。なお、オンラインカタログに掲載している特性や機能は文献情報等に基づくもので、それらを保証するものではありません。研究に必要な特性等については、利用者ご自身でご確認ください。
- 実施項目
- 受入時検査
- 保存標品作製時検査
新規に寄託または譲渡された微生物株を微生物株担当者が培養し、生残性、コロニー形態、細胞形態、コンタミネーションの有無などを確認します。 同時に PCR にて rRNA 遺伝子等の遺伝子領域を増幅して塩基配列を決定し、寄託者より提示された塩基配列や公開塩基配列との同一性を確認する遺伝子検査を行います。なお、遺伝子検査は2011年度以降に寄託された微生物株が対象です。2015年以降に寄託されたアーキア株については、細菌の16S rRNA遺伝子を増幅するPCR解析により、細菌の混入の有無も検査しています。
凍結保存、凍結乾燥保存、L-乾燥保存などの方法で作製された標品について、微生物株の生残性とコンタミネーションの有無を確認します。
- 未実施項目
オンラインカタログに掲載している特性や機能については、検査を実施していません。
- 追加実施項目
上記の実施項目以外の検査を実施した微生物株については、検査結果をカタログに記載しています。
微生物材料開発室で実施している標準的な遺伝子検査の手順は、以下の通りです。
(1) 菌体破砕液の調製
(2) PCR
(3) シークエンス解析
使用するもの
• 菌体破砕装置と破砕用消耗品
FastPrep-24 (MP Biomedicals)
ガラスビーズ (SIGMA acid-washed glass beads G4649 [≦106 µm] 等) 乾熱滅菌
2.0 mL スクリューキャップチューブ（アズワン C-2.0 など）
• DNA 精製キット
MultiScreen PCR96 フィルタープレート (メルクミリポア MSNU03010)
MonoFas DNA 精製キットI (GL Sciences)
• PCR
TaKaRa Ex Taq® Hot Start Version (タカラバイオ)
その他、遺伝子解析に必要な一般的な試薬、緩衝液、器具
(1) 菌体破砕液の調製
- 2.0 mL スクリューキャップマイクロチューブ（菌体破砕装置で使用できるもの）に、およそ 0.3 g のガラスビーズと 400 µL の TEバッファーを入れ、適量の菌体を懸濁する。
- FastPrep-24 を用いて菌体を破砕する。速度6、時間20秒を基本とする。
- 遠心分離により菌体破砕残渣を沈殿させた上清を新しいマイクロチューブに移し、菌体破砕液とする。
- 必要に応じて菌体破砕液を MonoFas で精製、濃縮する。
(2) PCR
- 菌体破砕液またはその精製溶液を適宜希釈したものを鋳型とする。
- 表1〜4 に示す PCR 反応溶液及びサイクル条件にて、標的遺伝子領域を増幅する。
- PCR 産物を電気泳動し、シーケンス解析に適した増幅産物が得られていることを確認する。
(3) シークエンス解析
- MultiScreen や MonoFas 等の DNA 精製キットにより、PCR 産物を精製する。
- シーケンサー指定の手順に従い、PCR 産物の塩基配列を決定する。シーケンスプライマーは表2に示すものから適宜選択する。
- シーケンスデータは必要な修正を加え、寄託者より提示された配列データと比較する。必要に応じて、塩基配列データベース上の配列データと比較する。
Table 1. PCR mixture
| Reagent | Volume (µL) |
|---|---|
| Milli-Q Water | 37.75 |
| 10 x Buffer | 5.0 |
| dNTPs (2.5 mM) | 4.0 |
| Forward primer (10 µM) | 1.0 |
| Reverse primer (10 µM) | 1.0 |
| TaKaRa Ex Taq® HS | 0.25 |
| Template DNA | 1.0 |
Total reaction volume 50 µL.
Table 2. Primers used in PCR amplificaion and sequencing
| Primer | Sequence (5’–3′) | Target Group |
|---|---|---|
| 27F1 | AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | Bacteria |
| 786F2 | GATTAGATACCCTGGTAG | Bacteria |
| 1492R3 | GGTTACCTTGTTACGACTT | Bacteria |
| 907R1 | CCGTCAATTCMTTTRAGTTT | Bacteria |
| 826R4 | GACTACCAGGGTATCTAATCC | Bacteria |
| 519R1 | GWATTACCGCGGCKGCTG | Bacteria/Archaea |
| 530F1 | GTGCCAGCMGCCGCGG | Bacteria/Archaea |
| 1053F2 | GCATGGCYGYCGTCAG | Bacteria/Archaea |
| A21F5 | TTCCGGTTGATCCYGCCGGA | Archaea |
| A348F6 | TCCAGGCCCTACGGG | Archaea |
| A1400R7 | GACGGGCGGTGTGTGC | Archaea |
| A1100R7 | CGGGTCTCGCTCGTT | Archaea |
| ITS58 | GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG | Fungi |
| ITS38 | GCATCGATGAAGAACGCAGC | Fungi |
| NL19 | GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG | Fungi |
| NL49 | GGTCCGTGTTTCAAGACGG | Fungi |
| ITS48 | TCCTCCGCTTATTGATATGC | Fungi |
| ITS28 | GCTGCGTTCTTCATCGATGC | Fungi |
Table 3. PCR primer sets
| Target Group | Primer set | Target gene |
|---|---|---|
| Bacteria | 27F + 1492R | 16S rRNA |
| Archaea | A21F + A1100R | 16S rRNA |
| Archaea | A21F + A1400R | 16S rRNA |
| Fungi | ITS5 + NL4 | ITS, LSU |
| Fungi | ITS5 + ITS4 | ITS |
| Fungi | NL1 + NL4 | LSU |
Table 4. PCR cycling condition
| Step | Temp. (°C) | Time |
|---|---|---|
| 1 | 98 | 2 min. |
| 2 | 98 | 10 sec. |
| 3 | 53 | 20 sec. |
| 4 | 72 | 60 sec. |
| 5 | Followed steps 2-4 by 30 to 35 cycles | |
| 6 | 72 | 5 min. |
| 7 | 10 | hold |
Reference
- Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing, In: Stackebrandt, E. and Goodfellow, M. (eds.), Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, pp. 115–176, Jon Wiley & Sons, Chichester.
- Baker, G. C., Smith, J. J., and Cowan, D. A. (2003). Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods 55: 541–555.
- Turner, S., Pryer, K. M., Miao, V. P., and Palmer, J. D. (1999). Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis. J. Euk. Microbiol. 46: 327–338.
- Youssef, N., Sheik, C. S., Krumholz, L. R., Najar, F. Z., Roe, B. A., and Elshahed, M. S. (2009). Comparison of species richness estimates obtained using nearly complete fragments and simulated pyrosequencing-generated fragments in 16S rRNA gene-based environmental surveys. Appl. Environ. Microbiol. 75: 5227–5236.
- DeLong, E. F. (1992). Archaea in coastal marine environments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5685–5689.
- Achenbach, L. and Woese, C. (1995). Appendix 6. 16S and 23S rRNA-like primers, In: Robb, F. T. and Place, A. R. (eds.), Archaea: a Laboratory Manual. Thermophiles, pp. 201-203, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
- Itoh, T., Suzuki, K., and Nakase, T. (1998). Occurrence of introns in the 16S rRNA genes of members of the genus Thermoproteus. Arch. Microbiol. 170: 155–161.
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., and Taylor, J. W. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, In: Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., and White, T. J. (eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, pp. 315-322, Academic Press, New York.
- O’Donell, K. (1993). Fusarium and its near relatives, In: Reynolds, D. R. and Taylor, J. W. (eds.), The Fungal Holomorph: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics, pp. 225-233, CAB International, Wallingford.
